Immunogenic potential of colorectal tumor cells after treatment with X-radiation and hyperthermia

Abstract

Cancer is one of the leading causes of death worldwide, both in developed and developing countries, resulting in millions of deaths each year. Among cancer entities, a recently published global cancer statistic showed that colorectal cancer is the third and second most common cancer in men and women, respectively [1]. On the one hand, cancer therapies should stop the proliferation of tumor cells and kill them, and on the other hand stimulate a specific immune response against residual cancer cells, stem cells, and micro-metastases. Common anti-tumor therapies consist of surgery, radiotherapy with ionizing radiation (X-ray), and chemotherapy, but various immune therapies and hyperthermia are used in addition in multimodal treatment concepts today. The positive therapeutic effects of temperature-controlled hyperthermia (HT), when combined with standard tumor therapies, have been shown in multiple randomized clinical trials (summarized in [2]). Biological research has revealed that HT induces radiosensitization. This synergistic mode of action is mainly based on the complementary targets of both X-Ray and HT treatment modalities. HT increases radiation-induced DNA damages and leads to selective destruction of tumor cells in hypoxic or acidic tumor parts. While X-radiation alone mainly induces a proliferative stop of the tumor cells and therefore local tumor control, X-ray combined with HT may induce systemic immune activating effects. Cell death induction by X-ray plus HT is worth analyzing because dying and dead cells are important modulators of the immune system, contributing to anti-inflammatory or pro-inflammatory responses depending on the respective form of cell death. While apoptotic cells are usually non- or even anti-inflammatory in order to avoid chronic autoimmunity, necrotic cells are able to induce strong immune responses. In this dissertation, we analyzed the impact of single and combined treatments of colorectal tumor cells with ionizing radiation (X-ray with a single dose of 5 or 10 Gy) and moderate hyperthermia (HT - 41.5 °C for 1 h) on the amount and form of tumor cell death. Furthermore, we analyzed the release of danger signals and the in vivo immunogenicity of the treated tumor cells. We showed that the amount of potentially immunogenic cell death forms was highly increased in colorectal tumor cell lines when the cells were treated with a combination of X-ray and HT. Those combined treatments led to an increased release of the danger signals HMGB1 and HSP70. While X-ray alone led to slightly diminished phagocytosis of treated tumor cells by macrophages and by dendritic cells, treating tumor cells with X-ray plus HT significantly increased phagocytosis. In addition, pro-inflammatory cytokines were released in higher amounts when HT plus X-ray treated tumor cells were phagocytosed, in comparison to X-ray-only treated cells. Furthermore, immature dendritic cells were shown to mature and become activated when incubated with supernatants of X-ray plus HT treated cells. An in vivo clonogenic assay revealed that cells treated with the combined therapies showed significant tumor growth retardation. Finally, immunogenicity of X-ray plus HT treated tumor cells was shown to be sustained in a xenogeneic immunization assay. Taken together, X-ray applied together with HT generate a beneficial tumor cure microenvironment and might lead to the induction of tumor-specific adaptive immune responses. We therefore conclude that hyperthermia is a very potent radiosensitizer, not only in regards to enhanced reduction of tumor clonogenicity, but also in regards to enhanced induction of immunogenic tumor cell death forms and stimulation of the immune system. Combining X-radiation with hyperthermia has multiple immune activating effects, which might be responsible for the beneficial impact on local and (in special cases) systemic tumor control seen in various clinical trials. [1] A. Jemal et al., 2011 [2] P. Schildkopf et al., 2010

Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit, sowohl in Industrie- als auch in Entwicklungsländern, und verursacht mehrere Millionen Todesfälle pro Jahr. Eine kürzlich veröffentlichte globale Krebsstatistik zeigte, dass das kolorektale Karzinom unter verschiedenen Krebsarten den dritt- und zweithäufigsten Krebs bei Männern bzw. Frauen darstellt [1]. Therapien gegen Krebs sollten einerseits die Proliferation der Tumorzellen verhindern und zum Zelltod führen, und andererseits eine spezifische Immunantwort gegen verbliebene Tumorzellen, Stammzellen und Mikro-Metastasen stimulieren. Zu den verbreiteten anti-Tumor Therapien gehören die Operation, Radiotherapie mit ionisierender Strahlung (X-ray) und Chemotherapie, aber zusätzlich werden heute verschiedene Immuntherapien und die Hyperthermie in multimodalen Behandlungskonzepten eingesetzt. Die positiven therapeutischen Effekte der Temperatur-kontrollierten Hyperthermie (HT), in Kombination mit Standard- Tumortherapien, konnten in mehreren randomisierten klinischen Studien gezeigt werden [2]. Die biologische Forschung hat gezeigt, dass die Behandlung mit Hyperthermie Radiosensibilisierung induziert. Diese synergistische Wirkungsweise basiert hauptsächlich auf den komplementären Zielen beider Behandlungsarten. Hyperthermie erhöht die bestrahlungsinduzierten DNA Schäden und führt zur selektiven Zerstörung der Tumorzellen in hypoxischen oder säurereichen Tumoranteilen. Während die ionisierende Strahlung alleine hauptsächlich einen Proliferations-Stopp der Tumorzellen induziert und daher zur lokalen Tumorkontrolle führt, ist die Kombination aus X-ray und Hyperthermie in der Lage systemische immunaktivierende Effekte auszulösen. Es lohnt sich, die Induktion des Zelltodes zu analysieren, da sterbende und tote Zellen wichtige Regulatoren des Immunsystems sind, die zu anti-inflammatorischen oder pro-inflammatorischen Immunantworten beitragen, in Abhängigkeit von der jeweiligen Zelltodesform. Während apoptotische Zellen normalerweise nicht- oder sogar anti-inflammatorisch wirken um chronische Autoimmunität zu vermeiden, sind nekrotische Zellen in der Lage starke Immunantworten auszulösen. In dieser Dissertation haben wir den Einfluss von Einzel- und Kombinationsbehandlungen kolorektaler Tumorzellen mit ionisierender Strahlung (X-ray mit Einzeldosen von 5 oder 10 Gy) und moderater Hyperthermie (HT – 41.5 °C für 1 h) auf die Menge und Zelltodesform der Tumorzellen untersucht. Darüber hinaus haben wir die Freisetzung von Gefahrensignalen und die in vivo Immunogenität der behandelten Tumorzellen analysiert. Wir haben gezeigt, dass in kolorektalen Tumorzelllinen die Menge an potentiell immunogenen Zelltodesformen stark erhöht wird, wenn die Zellen mit einer Kombination aus X-ray und HT behandelt wurden. Diese kombinierten Behandlungen führten zu erhöhten Mengen der freigesetzten Gefahrensignale HMGB1 und HSP70. Während X-ray alleine zu leicht verminderter Phagozytose der behandelten Tumorzellen in Makrophagen und Dendritischen Zellen führt, erhöht die Behandlung der Tumorzellen mit X-ray plus HT signifikant die Phagozytose. Zusätzlich wurden pro-inflammatorische Zytokine in höheren Mengen freigesetzt, wenn HT plus X-ray behandelte Zellen phagozytiert wurden, im Vergleich mit nur X-ray behandelten Zellen. Weiterhin wurde gezeigt, dass unreife Dendritische Zellen reifen und aktiviert werden, wenn sie mit Überständen von X-ray plus HT behandelten Zellen inkubiert werden. Ein in vivo klonogener Assay hat ergeben, dass bei Zellen die kombiniert behandelt wurden eine signifikante Wachstumsverzögerung erfolgt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass die Immunogenität von X-ray plus HT behandelten Tumorzellen in einem xenogenen Immunisierungs-Assay erhalten bleibt. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass X-ray in Kombination mit HT eine Tumor Mikroumgebung erzeugt, die für die Heilung fördernd ist und zur Induktion von tumor-spezifischen adaptiven Immunantworten führen kann. Daher kommen wir zu dem Schluss, dass Hyperthermie ein sehr potenter Radiosensibilisierer ist, nicht nur hinsichtlich einer erhöhten Reduktion der Tumor Klonogenität, sondern auch bezüglich der gesteigerten Induktion von immunogenen Zelltodesformen und einer Stimulation des Immunsystems. Die Kombination von X-ray mit HT hat mehrere immunaktivierende Effekte, welche für den positiven Einfluss auf die lokale und (in besonderen Fällen) systemische Tumorkontrolle verantwortlich sein könnten, die in vielen klinischen Studien gesehen wurden. [1] A. Jemal et al., 2011 [2] P. Schildkopf et al., 2010