Analysis of mesenchymal and epithelial interactions in the lung of gamma-Protocadherin-deficient mice and in chick embryonic lung cultures

Abstract

Diese Arbeit untersucht die Entwicklung der Wirbeltierlunge am Model von Hühnchen und Maus. Die Dokumentation der Histologie und Anatomie der sich entwickelnden Lunge ermöglichten eine genaue Untersuchung der verschiedenen epithelialen und mesenchymalen Gewebe in der Lunge. Anhand von in vitro Lungenkulturen konnten insbesondere die morphologischen Prozesse während der frühen Lungenentwicklung und Verzweigungsmorphogenese beschrieben werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression von Zelladhäsionsmolekülen, aus der Familie der gamma-Protocadherine (Pcdhγ), in mesenchymalen Strukturen in der Maus-Lunge charakterisiert und es wurde ein Phänotyp in Lungen von homozygoten Pcdhγ-defizienten gene-trap Mäusen beschrieben. Damit wurde erstmals gezeigt, dass gamma-Protocadherine eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Lungenmesenchyms spielen. Für die weiteren Untersuchungen war hilfreich, dass durch die b-galactosidase Aktivität des gene-trap Alleles die Morphologie der Lungen mit LacZ-Färbungen sehr gut sichtbar gemacht werden konnte.
 Das Pcdhγ gene-trap Allel entspricht einem funktionellen Nullallel (Ebert, 2006). Bisher wurde für homozygote Pcdhγ-defiziente Mäuse ein neuronaler Phänotyp mit Neurodegeneration vor allem in ventralen Bereichen des Rückenmarks beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nun ausserdem gezeigt, dass homozygote gene-trap Tiere ohne funktionelle Pcdhγ morphologische Veränderungen in spätembryonalen Entwicklungsstadien der Lunge aufweisen. Auffällig sind verdichtetes Mesenchym sowie fehlgebildete oder fehlende terminale Lungenbläschen im Vergleich mit wildtyp und heterozygoten Geschwistertieren. Diese Veränderungen deuten auf eine Rolle der Pcdhγ bei Differenzierungsprozessen während der späten Lungenentwicklung hin. Unsere Analysen zeigen, dass ähnlich wie im Nervensystem, auch in der Lunge ein deutlich erhöhter apoptotischer Zelltod beim Verlust von Pcdhγ nachweisbar ist. Beispielsweise war die Anzahl der apoptotischen Zellen in homozygoten Pcdhγ gene-trap Lungen bei E18,5 dreifach höher als die physiologisch auftretende Apoptose in den Lungen von Wurfgeschwistern.
 Der Notch Signalweg beeinflusst die proximo-distale Musterbildung in der Mauslunge und kann mittels Zugabe des Inhibitors DAPT in Organkulturen blockiert werden. Der Inhibitor (DAPT) verhindert die proteolytische Prozessierung von Notch durch die γ-Sekretase Presenilin und somit die Signalübertragung und Translokation der abgespaltenen intrazellulären Notch Domäne zum Nukleus. Auch die gamma-Protocadherine werden ähnlich wie Notch von der γ-Sekretase prozessiert. Aufgrund unserer Untersuchungen an Lungenkulturen konnte eine zusätzliche Signalfunktionen von Pcdhγ in der Frühentwicklung der Lunge jedoch ausgeschlossen werden, da sich die kultivierten Lungen von E11,5 und E12,5 Pcdhγ gene-trap Embryonen normal entwickelten und auch nach Zugabe von DAPT keine zusätzlichen oder verstarkten Veränderungen zeigten. Auch bei der Verwendung von zusätzlichen FGF10 Signalquellen in Form von Heparinacrylbeads oder nach Zugabe des FGF-Signalwegsinhibitors SU5402 zu den Lungenkulturen, die jeweils charakteristische Veränderungen der Verzweigungsmorphogenese bewirken, entwickelten sich Pcdhγ gene-trap Lungen analog zu wildtyp-Lungen.
 Ähnliche Organkulturen konnten im Rahmen dieser Arbeit auch für die Hühnchenlunge sehr gut und reproduzierbar etabliert werden und ermöglichten sowohl morphologische Studien als auch die Durchführung von in situ Hybridisierungen für verschiedene Markergene. Vor allem die frühen Stadien E5 bis E6 entwickelten sich in Kultur sehr gut weiter und die Morphologie dieser Lungen entspricht weitgehend der in vivo Lungenentwicklung beim Hühnchen. Da sich die Hühnchenlunge im Unterschied zur Mauslunge strikt seitensymmetrisch entwickelt, konnte das Kultursystem sehr gut für Lungenhalften adaptiert werden, die für Manipulationen besser zugänglich sind. Bei den folgenden Untersuchungen mit FGF10 Beads wurden drei spezifische Effekte in Hühnchenlungenkulturen gefunden. Der deutlichste Effekt, vor allem in anterior proximalen Regionen in der Nahe von der Trachea und dem ersten Bronchus, war gekennzeichnet durch ein Aufblähen des trachealen Epithels in der Nahe der FGF10 Quelle. Ein solcher Effekt wurde bei entsprechenden Experimenten in der Maus bisher nicht beschrieben. Ein weiterer Effekt war das gerichtete Wachstum des Epithels auf den FGF10 Bead hin. Dies unterstreicht eine mögliche Rolle von FGF bei der Chemotaxis auch in der Hühnchenlunge, die bereits für Mauslungen beschrieben wurde. Die in der Maus deutliche epitheliale Ummantelung von FGF10 Beads tritt hingegen beim Hühnchen nur selten und tendenziell eher in posterior distalen Regionen der Lunge auf. Ähnlich wie in der Maus konnten wir auch im Hühnchen einen deutlichen Anstieg der Expression von FGF Zielgenen wie cPea3 in Geweben um den FGF10 Bead zeigen. Beim Hühnchen lieferte die Zugabe des γ-secretase Inhibitors DAPT zu den Lungenkulturen erstaunliche neue Ergebnisse. Das respiratorische Epithel behandelter Lungen zeigte überall Auswölbungen auf, die neu gebildete Lungenknospen hervorzubringen schienen. Überraschenderweise ähnelte das Erscheinungsbild der DAPT behandelten Hühnchenlunge mit seiner signifikant erhöhten Anzahl von Verzeigungen damit der Morphologie einer Mauslunge. Diese Ergebnisse legen nahe, dass dem Notch-Signalweg auch bei der Hühnchenlunge eine bedeutende Rolle bei der Verzweigungsmorphogenese zukommt. Die Expression von gamma-Protocadherinen wurde ebenfalls im Mesenchym der Lungenkulturen nachgewiesen,zeigte aber ebenso wie weitere Marker keine Veränderung nach der Behandlung mit DAPT. Die erfolgreiche Etablierung der Hühnchen-Lungenkulturen ermöglicht nun die Untersuchung von weiteren Markern und eröffnet weitere Perspektiven für künftige Untersuchungen zur Regulation der Musterbildung während der Entwicklung der Vogellunge.