Caracterização funcional de dois cDNAs homólogos à ciclofilina e à proteína reprimida por auxina (ARP) identificados em bibliotecas subtrativas a para floração em tomateiro

Abstract

Flowering is a fundamental process in the life cycle for plant. This process is marked by vegetative to reproductive apical meristem conversion, due to interactions between several factors, both internal and external to plant. Therefore, eight subtractive libraries were constructed using apical meristem induced or not induced for two contrasting species: Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom and Solanum pimpinellifolium. Several cDNAs were identified and among these, were selected two cDNAs: one homologous cDNA to cyclophilin (LeCYP1) and the other to Auxin repressed protein (ARP). It has observed that LeCYP1 and ARP genes are important in the developmental process to plants. In silico analysis, were used several databases with the exclusion criterion E-value <1.0x10-15. As a result, conservation was observed for proteins analyzed by means of multiple alignments and the presence of functional domains. Then, overexpression cassettes were constructed for the ARP cDNA in sense and antisense orientations. For this step, it was used the CaMV35S promoter. The cDNA orientation (sense or antisense) in relation to the promoter was determined by restriction enzymes and sequencing. Then, this cassette was transferred to binary vector pZP211 and these cassettes were transferred into Agrobacterium tumefaciens LBA4404. S. lycopersicum cv. Micro-Tom (MT) and MT-Rg1 plants were transformed. In addition, seedlings were subjected to hormone treatments using a synthetic auxin (- naphthalene acetic acid) and cyclosporin A (cyclophilin inhibitor) treatments and it was found that the hormone treatment there were changes in development of lateral roots pattern, probably related to decreases in auxin signaling caused by reduction of LeCYP1 in MT-dgt plants while cyclosporin A treatments, there was a slight delay in flowering in cv. MT plants. Furthermore, assay with real-time PCR (RT-qPCR) were done for expression level analysis from LeCYP1 and ARP in order to functionally characterize these sequences in tomato plants.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

A floração é fundamental no ciclo de vida de uma planta. Este processo é marcado pela conversão do meristema apical vegetativo em reprodutivo, devido a interações entre diversos fatores, tanto internos quanto externos à planta. Diante disso, foram construídas oito bibliotecas subtrativa utilizando ápices meristemáticos induzidos e não induzidos para a floração de duas espécies de tomateiro: Solanum lycopersicum cv Micro-Tom e S. pimpinellifolium. Inúmeros cDNAs foram identificados e dentre estes, foram selecionados o cDNA homólogo a ciclofilina (LeCYP1) e a Proteína Reprimida por Auxina (ARP) para a caracterização in silico e funcional em espécie de tomateiro. Tem sido observado em outros sistemas vegetais que os genes LeCYP1 e ARP são importantes no processo de desenvolvimento da planta. Na análise in silico, foram utilizados diversos bancos de dados, tendo como critério de exclusão o E-value <1.0x10-15. Uma conservação para as proteínas analisadas foi observada por meio dos alinhamentos múltiplos e a presença de domínios funcionais. Em seguida, foram realizadas construções de cassetes de superexpressão para o cDNA homólogo à ARP em orientação senso e antissenso. Para esta etapa, foi utilizado o promotor forte CaMV35S presente no vetor intermediário pBC (Stratagene). A orientação do cDNA (senso ou antissenso) em relação ao promotor foi determinada por meio de enzimas de restrição e sequenciamento dos potenciais clones. Em seguida, este cassete foi transferido para o vetor binário pZP211 e os clones obtidos foram confirmados pelo padrão de restrição utilizando diferentes enzimas. Subsequentemente, estes cassetes foram transferidos para a Agrobacterium tumefaciens LBA4404 e posteriormente transformado em plantas de S. lycopersicum cv. Micro-Tom (MT) e MT-Rg1. Em adição, plântulas foram submetidas a tratamentos hormonais utilizando uma auxina sintética (ácido -naftaleno acético) e com ciclosporina A (inibidor de ciclofilina) e foi constatado que no tratamento hormonal houve alterações no padrão de desenvolvimento das raízes laterais, provavelmente relacionada ao déficit na sinalização da auxina ocasionada pela redução de LeCYP1 em plantas MT-dgt, enquanto que no tratamento com ciclosporina A, ocorreu um atraso no florescimento de plantas cv MT. Além disso, ensaios de PCR em tempo real (RT-qPCR) foram efetuados para análise de expressão dos cDNAs homólogos a LeCYP1 e ARP de modo a caracterizarmos funcionalmente estas sequências em plantas de tomateiro.